Studium a hodnocení karcinogeneze

Karcinogeneze je studována pomocí různých standardizovaných toxikologických testů. První část těchto testů se provádí in vitro a - pokud jsou pozitivní - přistoupíme k experimentům in vivo. Tento experimentální přístup krok za krokem se nazývá ROZHODNUTÍ O BODU ROZHODNUTÍ, sled pokusů, které se zastaví na konci každého pokusu, aby se rozhodlo, jak v procesu pokračovat. Existuje pět fází:

FÁZE A: struktura a vlastnosti karcinogenní sloučeniny;

FÁZE: v této fázi krátkodobého testování in vitro se používají savčí buňky. Nejčastěji používanými buňkami jsou hepatocyty, protože se studuje rozsah opravy poškození, které hepatocyt vyvíjí podle závažnosti poškození způsobeného látkou. Stručně řečeno, neurčujeme poškození samo o sobě, ale kolik opravného systému bylo aktivováno jaterní buňkou.

Implementovaným postupem je vytvoření 3 kultur hepatocytů.V první kultuře jsou hepatocyty zdravé, ve druhé jsou ošetřeny testovanou látkou a nakonec ve třetí jsou ošetřeny kontrolní látkou, která je určitě karcinogenní. Tyto tři kultury obsahují radioaktivní pyrimidinovou bázi, což je tritiovaný thymidin, který působí jako marker.

Pokud zkoumaná sloučenina způsobí mutaci DNA, buňka na tento problém reaguje aktivací opravných systémů. Kus DNA, který prošel mutací, je naříznut a díky působení DNApolymerázy je chybějící část nahrazena novou. Ke korekci použije DNApolymeráza nové báze, včetně tritiovaného thymidinu. Je začleněna radioaktivní báze. Analýza radioaktivity určuje úroveň mutace v ošetřených buňkách: čím vyšší je radioaktivita, tím větší jsou mutace DNA.

Ve fázi B se také provádějí testy na bakteriích, aby bylo možné studovat, zda existují nějaké reverzní mutace. Použité bakterie jsou salmonely již nositeli mutací. Mutace se týká syntézy histidinu, takže salmonely nejsou schopné růst bez histidinu. Tyto bakteriální kolonie jsou zčásti odebrány k ošetření testovanou látkou, částečně pro negativní kontrolu a částečně pro pozitivní kontrolu, poté testovány se známým karcinogenem. Pokud je tato testovaná látka nepřímou genotoxickou, musí být do kultivačního média zavedeny metabolizující enzymy. V tomto okamžiku existují 3 kultury, které budou naočkovány a pěstovány v Petriho miskách (v kultivačním médiu není histidin). Pokud v testovaném karcinogenu nedošlo k žádným mutacím, teoreticky by na miskách neměla být žádná „Pokud došlo k mutagennímu působení karcinogenu, mohlo to změnit první mutaci a vytvořit druhou mutaci schopnou růst bakterií na kultivačním médiu bez histidinu. V tomto případě druhá mutace, která modifikuje první mutaci a bere název RETROMUTACE Pokud dojde k výraznému růstu piasta petri, je karcinogen přímý.
Vždy pomocí testu in vitro je možné určit chromozomální integritu. Tento test se vždy provádí na savčích buňkách a používá se k testování toxických látek schopných způsobit mutace některých enzymů odpovědných za biosyntézu DNA. Látka, která má být testována je podroben analýze in vitro Aby bylo možné určit, zda zkoumaná látka ovlivňuje integritu a počet přítomných chromozomů, používá se mikronukleární test. Mikrojádra jsou váčky, které jsou tvořeny částí chromatinu uvnitř. Chromatinem začleněným do těchto mikrojáder mohou být buď celé chromozomy, nebo fragmenty chromozomů. Mikrojádra jsou tvořena nesprávným buněčným dělením, což vede ke vzniku dceřiných buněk s genetickým materiálem, který není stejný distribuovány. Výsledkem tohoto testu bude stanovení látek, které jsou definovány klastogenními a vřetenovými jedy. Klastogenní látka produkuje mikrojádra s acentrickými fragmenty chromozomů, takže látka vyvolává zlomení chromozomů, místo toho jedovatá látka vřetene produkuje mikrojádra, ve kterých se nacházejí celé chromozomy.
Pokud zkoumaná látka vyvolává genotoxicitu v jednom nebo více testech, je to definováno jako vysoce podezřelé, takže jde přímo do fáze D. Pokud naopak testovaná látka nevyvolává žádný genotoxický účinek, přechází do fáze studie C, protože to může být promotér.

FASEC: v této fázi lze provádět testy in vitro i in vivo.

U testů in vitro by mohla být prokázána možnost promotorové látky prolomit mezerové spoje mezi normálními buňkami a nádorovými buňkami, s následným průchodem látek mezi oběma buňkami.

Test in vivo je indukce kožních nádorů u myší. Testovaná látka se aplikuje dvakrát nebo třikrát týdně na kůži myši. Pokud je tato látka promotorem, mohou do 2/3 měsíců dojít k tvorbě papilomů. U myší se berou v úvahu dvě hlavní data: počet myší postižených papilomy a počet papilomů přítomných na každém zvířeti. Pokud látka působí jako promotor a vyvine u léčené myši nádor, znamená to, že se skutečně jedná o látku s promotorovým účinkem.

Jakmile jsou tyto testy dokončeny, přejdeme k dlouhodobým testům in vivo.

FASED: v této fázi jsou testovány všechny sloučeniny, které prokazují mutagenitu, a všechny sloučeniny, které neprokazují mutagenitu. Testy, které lze provést, jsou různé, z nichž některé jsou testy prováděné na játrech, plicích a nakonec na prsu.

Jaterní test prokazuje tvorbu nikoli nově vytvořeného nádoru, ale neoplastického ohniska, tedy něčeho, co se připravuje na to, aby se stal nádorem. Buňky tohoto zaměření jsou již atypickými buňkami, proto prošly mutací a připravují se na to, aby se staly neoplastickými buňkami. Po určité době se díky pitevnímu vyšetření určí tvorba pre-neoplastických fokusů, a to výpočtem počtu a rozsahu těchto pre-neoplastických formací.

Plicní test umožňuje stanovení adenomu, což je "anomálie buněk plicní tkáně. Také v tomto případě se plicní tkáň potkana zkoumá po poměrně dlouhé době (měsíce) (tyto adenomy jsou snadno identifikovatelné, protože jsou bělavé uzlíky na plicním epitelu).
Prsní test umožňuje stanovení nádorů v žlázové tkáni. Hodnotí se vždy počet vytvořených adenomů a počet zvířat vykazujících adenomy.

Pokud jsou z těchto testů pozitivní výsledky, je testovaná látka skutečně karcinogenní. V tomto okamžiku přejdeme k provádění nákladných testů s velmi dlouhými časy provedení.

FÁZE: v této fázi je dlouhodobým testům podroben proměnlivý počet zvířat od 20 do 50. Tyto testy jsou velmi nákladné a získání určitých výsledků trvá dlouho; mluvíme o asi 1/8 života zvířete.Je možné, že během těchto testů některá zvířata uhynou, ale vždy jsou studována pitvou a histologickým typovým vyšetřením. Vybraná zvířata jsou vždy krysy a myši a pouze 70–80% přežívá až do konce dlouhodobých testů. Použitá zvířata jsou právě odstavená, protože čím jsou mladší, tím jsou citlivější na léčbu. Během dlouhodobého testovacího období je výzkumník vždy podporován matematikem-statistikem, který je schopen vzít v úvahu všechny shromážděné informace a reprodukovat různá data.

Dávky testované na zvířatech začínají od maximální tolerované dávky a všech jejích dílčích násobků a hodnotí se reakce reakce na dávku u zvířete.
Podávání se musí vždy přiblížit cestě, kterou se muž může dostat do kontaktu s vyšetřovanou látkou, tedy orální, kožní nebo dýchací cestou, přičemž pokud se testuje karcinogenita léčiva, je také užitečné provádět intravenózní podání.
Testované skupiny zvířat jsou 4 (50 zvířat pro každou skupinu):

Skupina NAIF, která nemá žádnou léčbu;
Skupina ošetřená vehikulem;
Skupina ošetřená testovanou látkou;
Skupina léčená známým karcinogenem.

Je velmi důležité, aby počet zvířat v každé skupině byl co nejvíce stejný. Ve skutečnosti, pokud je v počtu zvířat příliš velký rozdíl, může se statistický test ukázat jako falešný.
Prováděná hodnocení jsou:

Celková frekvence nádorů;
Frekvence některých nádorů;
Frekvence zvířat s více než jedním typem nádoru;
Počet rakovin zvířat.

Na konci všech těchto fází studie je látka zařazena do žebříčku stanoveného IARC (Mezinárodní agenturou pro výzkum a vývoj rakoviny) a Agenturou pro ochranu životního prostředí (EPA).